代谢工程(Metabolic Engineering)在运动发酵单胞菌中(Zymomonas mobilis)的应用

代谢工程在运动发酵单胞菌中的应用

化石燃料的价格不断上涨与储存减少，CO2引起的温室效应，环境保护与可持续发展等这些问题，促使人们寻求一种环境友好的可再生能源。生物乙醇作为一种可再生的能源越来越受到人们的关注。但是，从淀粉等原来生产得乙醇不能满足作为燃料的需求，只有扩大原料范围，从玉米秆等纤维质原料发酵生产乙醇，才能够可持续的发展生物乙醇产业。从纤维素原料水解液发酵生产乙醇对代谢工程及工程菌来说是一个大的挑战[1-3]。纤维素原料经过预处理，酶水解之后，水解液中有葡萄糖，木糖，阿拉伯糖，以及其他降解产物等，为了发酵过程的经济性，需要能够有效共发酵这些糖的微生物。目前发现的微生物不能够有效的共发酵己糖和戊糖。代谢工程定义为通过重组DNA技术，对特定的生化反应进行有目的的修饰或引入新的路径，从而提高目的产物的形成。代谢工程一个基本的应用就是拓宽微生物的基质范围[4]，这正是纤维素乙醇发酵菌株所面临的问题。代谢工程重组的大肠杆菌，酿酒酵母，运动发酵单胞菌能够共发酵己糖和戊糖，这是现在研究评估较多的三种共发酵工程菌。运动发酵单胞菌以其独特的发酵机理和发酵性能[5-6]，被美国国家可再生能源实验室（NREL）选做发酵纤维素水解液的菌株，并被用于其合作伙伴杜邦公司（Dupont）商业化纤维素乙醇生产。

1． 运动发酵单胞菌代谢葡萄糖的ED路径

运动发酵单胞菌属微好氧菌，能够在厌氧条件下通过ED途径代谢葡萄糖，生产乙醇。但是ED途径大多是严格好氧的微生物如嗜糖假单胞菌的代谢路径，这正是运动发酵单胞菌发酵的独特之处。

图.1 运动发酵单胞菌的ED途径[8]
Stern等通过放射性呼吸方法验证了运动发酵单胞菌缺乏TCA循环途径，葡萄糖只能经过ED途径代谢，实验发现C-1迅速而且完全转化成CO2，这表明由葡萄糖生成的丙酮酸已经脱羧；同时发现C-2 和C-6的CO2几乎没有，这表明丙酮酸脱羧产物没有进一步被氧化[7]。运动发酵单胞菌通过ED途径将1mol葡萄糖转化为2mol乙醇，产生1mol ATP，不像酵母发酵所利用的EMP糖酵解途径，1mol葡萄糖转化成乙醇要生成2mol ATP。运动发酵单胞菌其低的ATP得率导致生成低的生物量及潜在的高的乙醇的得率。正如图1所示，ED途径源自氧化磷酸戊糖途径（HMP）生成NADPH这一步。葡萄糖在ATP与磷酸转移酶作用下生成葡萄糖-6-P，这一步可以与EMP途径相连接。葡萄糖-6-磷酸在氧化还原酶作用下生成葡萄糖1，5-内酯-6-磷酸 ，再在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化下生成6-磷酸-葡糖酸，这一步可以与（HMP）相连接。代谢流从非氧化HMP发生了关键的转移即在6-磷酸-葡糖酸脱水酶作用下6-磷酸-葡糖酸生成2-酮-3-脱氢-6-磷酸葡糖酸（KDPG），在KDPG醛缩酶生成3-磷酸甘油醛和丙酮酸。3-磷酸甘油醛在Pi，ADP，与NAD+作用下（EMP），转化为丙酮酸，生成2分子ATP 和1分子的NADH+H+ ；最后丙酮酸脱羧生成2分子的乙醇和CO2。在运动发酵单胞菌中解码6-磷酸-葡糖酸脱水酶蛋白的基因包含在一个6Kb的基因簇里，该簇里其他基因也用于葡萄糖代谢。但是，这一脱水酶在其他细菌里也存在，所以说运动发酵单胞菌能够发酵葡萄糖产乙醇不单是因为存在这个酶。运动发酵单胞菌中编码含有糖酵解途径酶的所有基因，缺失磷酸果糖激酶，因而糖酵解途径就不能进行。运动发酵单胞菌没有酮戊二酸脱氢酶，苹果酸脱氢酶，使其只有不完整的TCA途径，这不影响氨基酸的合成，但是限制了ATP的合成。运动发酵单胞菌也缺失大多数硫酸戊糖途径的基因，这限制了其它糖的代谢，这也提供了为其增加木糖与阿拉伯糖代谢路径的机会[8]

2.戊糖代谢在运动发酵单胞菌中的构建
2.1 木糖在运动发酵单胞菌中的代谢
ZHANG等[9]将戊糖吸收及磷酸戊糖途径基因表达在运动发酵单胞菌中，拓宽了运动发酵单胞菌的基质范围。在用运动发酵单胞菌中表达了大肠杆菌中的木糖异构酶基因(xylA)、木酮糖激酶基因(xylB)、转醛酶基因(ta1)、转酮酶基因(tktA)。将这4个基因分2组(xylA和xym，tal和tktA)，组成2个操纵子，分别置于运动发酵单胞菌自身的3-P-甘油醛脱氢酶启动子和烯醇酶启动子下，并将这2个操纵子构建成1个质粒，含有这种质粒的运动发酵单胞菌可以发酵木糖产生乙醇。在CP4(pZB5)中木糖在木糖异构酶的催化下转化为木酮糖，木酮糖激酶的作用下得到木酮糖-5-磷酸，然后再在转酮糖酶催化下生成3-磷酸甘油醛；转醛糖酶催化下生成4-磷酸赤藓糖与6-磷酸果糖；4-磷酸赤藓糖 再转化为3-磷酸甘油醛；6-磷酸果糖 转化为ED途径中6-磷酸葡萄糖，3-磷酸甘油醛也进入ED途径，最终生成乙醇与CO2。代谢己糖和木糖产生乙醇的总反应式:

Glucose+ADP+Pi 2Ethanol+2CO2+ATP
3Xylose+3ADP+3Pi 5Ethanol+5CO2+3ATP

通过这个反应式可以计算理论上消耗每克木糖获得0.51g乙醇。在这个新的代谢路径中，即HMP与ED相关联的途径，消耗3mol木糖获得得ATP比传统的木糖通过HMP与EMP相结合得途径要少2molATP。因为用于生物量合成的基质很少，木糖在运动发酵单胞菌产乙醇的能力比其它已知微生物效率更高。
CP4(pZB5)质粒构建及重组质粒转化包括：木糖异构酶和木酮糖激酶的分离并熔合到
3-P-甘油醛脱氢酶(GAP)启动子上，转醛酶和转酮酶基因的分离并熔合到烯醇酶(ENO)启动子上；穿梭载体的构建和木糖吸收及磷酸戊糖途径转换化运动发酵单胞菌

图.2 重组运动发酵单胞菌中的戊糖代谢与ED途径 图.3 Pgap-/xylA/xylB, Peno-tal/tktA操纵子和质粒pZB5

2.2 阿拉伯糖在运动发酵单胞菌中的代谢

戊糖代谢路径在运动发酵单胞菌中成功构建后，美国可在生能源实验室（NREL）研究者通过基因工程在运动发酵单胞菌表达相关基因，使阿拉伯糖也能够成功被代谢[10]。通过表达从大肠杆菌中分离的五个基因，阿拉伯糖异构酶(araA)，核酮糖激酶(araB), L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶(araD), 转醛醇酶(talB), 转酮醇酶(tktA),放在特定的启动子下面使其可以在葡萄糖存在下表达。阿拉伯糖在异构酶催化转化为核酮糖，核酮糖在核酮糖激酶作用下转化为5-磷酸核酮糖，再在L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶催化下生成5-磷酸木酮糖，最后经过转醛醇酶，转酮醇酶，以6-磷酸果糖，3-磷酸甘油醛的形式进入ED途径，生成乙醇和CO2。该基因工程菌株能够以阿拉伯糖为唯一碳源的培养基上生长，获得理论值98%的乙醇，这表明阿拉伯躺绝大多数都转化用于生成乙醇。通过磷酸戊糖途径HMP与ED途径的结合，阿拉伯糖获得了有效的发酵。通过引入阿拉伯糖吸收基因和磷酸戊糖途径的非氧化部分，使得阿拉伯糖的代谢与ED途径有效的关联。在发酵反应中3mol 阿拉伯糖转化为5mol乙醇：
3 L-arabinose+3ADP+ 3 Pi . 5ethanol+ 5CO2 +3ATP+3H2O

每克阿拉伯糖生成0.51g乙醇，在这个新的代谢路径中，消耗3mol阿拉伯糖获得ATP比传统的阿拉伯糖通过HMP与EMP相结合的途径要少2molATP ，这与木糖发酵的能量效率一样。在葡萄糖和阿拉伯糖共存的培养基中，阿拉伯糖的利用速率要慢的多，几乎要到葡萄糖耗尽才能利用阿拉伯糖。而对于葡萄糖和木糖糖混合的培养基，虽然木糖利用速率要慢于葡萄糖，但是它们是同时利用的。因此，运动发酵单胞菌中的糖吸收系统比较有利用葡萄糖，必须进一步提高木糖及阿拉伯糖的吸收能力，这样才有利于把重组的运动发酵单胞菌用于发酵纤维素水解液。

图.4 重组运动发酵单胞菌中的阿拉伯糖代谢路径 图.5 含有阿拉伯糖吸收及磷酸戊糖路径基因的质粒pZB206

3.运动发酵单胞菌代谢通量分析及戊糖发酵优化
3.1 线性规划分析重组运动发酵单胞菌代谢能力
Tsantili 等[11]构建了重组运动发酵单胞菌的代谢网络，使其可以利用代谢工程的方法模型化。利用线性规划，分析和确定了不同生物目的代谢边界，边界的确定主要是通过运动发酵单胞菌的化学计量的连接性。研究揭露了该细菌生长反应的本质，阐明代谢路径的相互关系，特别是产物与副产物形成之间，也指出乙醇的生成和生物量的形成直接依赖于厌氧呼吸的化学计量与活性。因此，为了能过通过改进特定基因优化运动发酵胞菌，我们必须进一步理解和分析运动发酵单胞菌的厌氧呼吸和氧化还原势。运用线性规划分析运动发酵单胞菌的生理学，可以从化学反应连接性来确定影响特定生物合成目的的主要因素。
图.6 用于线性规划重建的运动发酵单胞菌代谢网络. 数字代谢该路径的反应
图.7 以最大乙醇产率为目标的最优代谢流分布 反应箭头旁的三个流量数字从上到下分别代表，以葡萄糖为唯一碳源；以木糖为唯一碳源；以葡萄糖，木糖各50%为碳源。

作者用线性规划的方法分别确定了以最大能量，乙醇，生物量为目表的代谢路径边界，指出删除运动发酵单胞菌上某一个基因和两个基因所引起的对生长，乙醇生产能力的影响需要进一步研究。研究主要结果是：运动发酵单胞菌代谢网络缺乏消耗多余的ATP的弹性,这限制了乙醇的生成，使得有必要合成甘油作为竞争产物；菌体生长和乙醇的生产对于基质的消耗是竞争性的，最大的生长伴随着乙醇的形成。

3.2 动力学优化运动发酵单胞菌戊糖发酵[12]

通过假定运动发酵单胞菌包含磷酸戊糖途径（PP）和ED途径的代谢网络，借助了一个包含该网络所有酶反应的动力学模型，研究优化该代谢网络。通过动力学模型能够动态模拟PP和ED途径的胞内代谢物浓度，这个动力学模型能够预测当不同的酶浓度发生变化时是如何影响胞内代谢产物浓度以及乙醇的浓度。在连续的发酵中，五种酶的浓度做为输入变量，乙醇的浓度优化条件为木糖异构酶为最高水平，其次为转醛醇酶浓度。模型也预测到磷酸葡糖异构酶不需要过量表达，实验也证实了这一点。
通过动力学研究，为提高木糖发酵运动发酵单胞菌建议了可能的方法，即如何在最少程度破坏细胞生理的条件下，优化表达异源基因的水平，不恰当的构建会引起胞内代谢物积累和生长分担过重。动力学研究能够让我们看到流量是如何在PP和ED途径中分布的，同时也可以明白其他的代谢产物是如何调节和影响非线性的反应，从而有利于我们最大效率的表达外源基因。
动力学分析表明，对于胞外乙醇浓度影响最大的三种酶是木糖异构酶，转醛醇酶，木酮糖激酶。这原因可能是这些异源的酶控制着PP途径的通量，它们水平的提高能够消除代谢路径的瓶颈，从而积累中间代谢产物。模型预测发现相对低浓度的自有的磷酸葡萄糖异构酶和异源表达的转酮醇酶，能够获得最大的乙醇产量。动态平衡方程式和非线性酶动力学表达式，为进一步模拟动态发酵提供了强有力的框架。
图.8最优乙醇生产效率时的PP途径和糖酵解途径酶反应速率

3.3 核磁共振技术研究重组运动发酵单胞菌

13C 和 31P核磁共振技术用来研究产物形成路径以及代谢的能量状态。31P核磁共振技术测定胞内磷酸核苷，其他能量化合物，以及胞内pH的变化，反映出细胞的能量状态。重组运动菌在共发酵葡萄糖和木糖混合培养基时表现二次生长，在以木糖为唯一碳源时表现出低的生物量，乙醇形成速率慢等问题。核磁共振技术研究表明同葡萄糖相比，以木糖为培养基细胞得率低的原因可能是：由于质粒的维持而增加了代谢负担；木糖代谢副产物的形成损失了碳源和能量；木糖代谢产物对生长的抑制；木糖发酵过程中，木糖低的吸收速率导致细胞低的能量化状态[13]。13C 和 31P核磁共振技术也用在乙酸对重组菌株抑制的机理研究[14-15]。纤维素水解液中存在许多抑制微生物生长的物质，特别是乙酸在水解液中含量大，而且对重组运动发酵单胞菌的抑制作用最强。乙酸的抑制作用事酸化细胞质。当存在乙酸的时候胞内磷酸糖和NTP水平下降，这表明胞内低能量状态是抑制的主要机理之一。

4.结语

运动发酵单胞菌ZM4全基因序列的报道[16]，进一步增强了人们对运动发酵单胞菌的理解，为代谢工程的运用开辟了更广阔的途径。运动发酵单胞菌具有不完全的TCA循环，可以通过代谢工程改变代谢流生产有机酸和TCA循环中间代谢物如琥珀酸[17]。重组运动发酵单胞菌在纤维素水解发酵方面仍存在许多问题如己糖和戊糖共发酵效率，戊糖的吸收能力，抑制物的耐受性等。有报道通过在运动发酵单胞菌克隆表达质子缓冲缩氨酸的基因[18]来提高其对酸的耐受性。随着组学，系统生物学[19]，代谢工程等发展和应用于重组运动发酵单胞菌，相信能够进一步提高其能力，实现其在纤维素水解液发酵中的商业化生产和应用。


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